一、蛋白提取
蛋白分析的第一步是蛋白提取，蛋白提取方法包括化學抽提法、物理抽提法和生物學抽提法。蛋白提取無論通過機械處理還是基于去垢劑的提取方法，都會不可避免地破壞細胞穩態，導致蛋白降解或不穩定。因此，提取過程中蛋白的完整性直接決定了下游蛋白樣品分析所得數據的質量。
樣品類型
關于內源性蛋白和表達系統蛋白的研究來源主要包括哺乳動物細胞，哺乳動物組織和原代細胞。當提取哺乳動物組織中的蛋白質時，需要一些溫和的酶或機械破碎手段來幫助從較復雜組織基質中分離細胞。對于僅通過質膜將細胞內容物與環境隔離開的培養哺乳動物細胞和原代細胞來說，試劑中的去垢劑可打破蛋白-脂質膜雙層結構，使總蛋白提取更為容易。通常所研究的或用于重組蛋白表達系統的其他生物體包括細菌、酵母和植物。這些細胞類型含有細胞壁，需要額外使用酶解或機械破碎的方法才能有效釋放蛋白。然而，目前已開發出基于去垢劑的解決方案，可有效提取和溶解這些細胞中的蛋白，而無需機械外力破壞。該方法對于處理更多樣品數量或使用自動提取和純化方案來說尤其重要。
亞細胞分級分離
對于大多數研究來說，只需直接制備全細胞裂解物以獲取可溶蛋白樣品，用于下游直接檢測或進一步純化與分離。但是，如果在蛋白提取之前將細胞分為不同的區室或細胞器，可以顯著提高特定蛋白的產量或富集率。機械裂解通常會破壞所有細胞區室，使分離特定細胞組分變得更加困難。但是，通過謹慎優化試劑，已開發出基于逐級差異去垢劑的方法來分離核蛋白、胞質蛋白和膜蛋白組分。該方法可以將疏水性膜蛋白溶解，使其與親水蛋白分離，并且可以分離完整細胞核、線粒體和其他細胞器，用于直接研究或分步提取蛋白。
二、蛋白質降解
細胞裂解時會破壞細胞膜和細胞器，導致蛋白水解活性不受調控，從而降低蛋白產量并影響蛋白功能。為了防止提取的蛋白降解并保持其活性，通常需要在細胞裂解試劑中添加蛋白酶和磷酸酶抑制劑。
蛋白酶抑制劑通過與蛋白酶活性位點結合而起作用。由于蛋白水解機制的差異，單一化合物無法有效抑制所有蛋白酶，因此，需要使用幾種不同抑制劑的混合物來確保蛋白提取物在下游分析之前不被降解。典型的抑制劑混合物包括絲氨酸、半胱氨酸和天冬氨酸蛋白酶等小分子抑制劑，以及氨基肽酶和金屬蛋白酶。盡管有些抑制劑是不可逆的，但很多抑制劑是可逆的，它們需要長時間存在于粗制樣品中，直到后續進行了純化，免除了蛋白水解活性的風險為止。
同樣，磷酸酶也各有不同，因此建議使用有效的磷酸酶混合物（含絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、酸性和堿性磷酸酶的抑制劑）來保持脆弱的磷酸化翻譯后修飾。
通過使用正確的保存方法來防止靶蛋白降解：
快速操作并保持樣品低溫（可使用液氮冷凍樣品）；
抑制或滅活內源性蛋白酶和磷酸酶；
添加保護或穩定化合物，例如還原劑和酶抑制劑；
通過沉淀穩定或滅活蛋白。
三、蛋白樣品除雜
蛋白提取后，蛋白樣品通常含有影響蛋白穩定性或與下游應用不兼容的雜質。透析、脫鹽和濃縮是去除蛋白樣品中常見小分子污染物（例如鹽和去垢劑）的三種常用方法。根據下游應用要求，選擇方法時的考慮因素可能包括樣品起始量、蛋白功能和處理時間。透析、脫鹽和濃縮的有多種規格和包裝形式。
透析
透析是一種經典分離技術，它通過半透膜選擇性擴散，去除蛋白溶液中的小分子和不需要的化合物。將樣品和緩沖液置于膜的相對側。大于膜孔的蛋白保留在膜的樣品側，較小的分子（污染物）通過膜自由擴散，直至達到平衡濃度。這種技術可以使樣品中小分子污染物的濃度降低至可接受水平。
脫鹽
常用的脫鹽方法有透析法、電透析法和凝膠過濾法。透析法及電透析法耗時長，樣品稀釋度大，不易放大進行大規模生產，所以工業生產中應用較少。凝膠過濾層析脫鹽過程中鹽分子和蛋白質分子大小差異巨大，蛋白質溶液中小分子的鹽分子隨著層析流動相進入孔徑較小的固定相，使其在層析中的遷移速率小，而蛋白質因分子尺寸較大，不能隨流動相進入固定相中，因此在層析柱中的遷移速率大，首先從層析術中流出，實現脫鹽。
濃縮
蛋白濃縮與透析法類似，其使用半透膜將蛋白與小分子量化合物分離。與透析法的被動擴散原理不同，濃縮是通過離心使溶液穿過膜而實現的。在離心過程中，緩沖液和小分子量溶質均被動穿過膜，并在另一側收集（濾液）。大分子（蛋白）保留在膜的樣品側，其隨著試劑被動穿過膜到達另一側而濃縮為小體積液體（截留液）。
四、蛋白定量
紫外分光光度法
蛋白質分子中存在含有共軛雙鍵的酪氨酸和色氨酸，使蛋白質對280nm的光波具有最大吸收值，在一定的范圍內，蛋白質溶液的吸光值與其濃度成正比，可作定量測定。該法操作簡單、快捷，并且測定的樣品可以回收，低濃度鹽類不干擾測定結果，故在蛋白質和酶的生化制備中廣泛被采用。但此方法存在以下缺點：
1.當待測的蛋白質中酪氨酸和色氨酸殘基含量差別較大會產生一定的誤差，故該法適用于測定與標準蛋白質氨基酸組成相似的樣品。
2.若樣品中含有其他在280nm吸收的物質如核酸等化合物，就會出現較大的干擾。但核酸的吸收高峰在260nm，因此分別測定280nm和260nm兩處的光吸收值，通過計算可以適當的消除核酸對于測定蛋白質濃度的干擾作用。但因為不同的蛋白質和核酸的紫外吸收是不同的，雖經校正，測定結果還存在著一定的誤差。
熒光法蛋白定量
基于熒光進行蛋白定量是除比色法以外的另一選擇。熒光檢測法具有出色的靈敏度，所需蛋白樣品量少，可節省更多樣品用于其他實驗。此外，讀取時間并非關鍵因素，因此這種檢測方法可輕松應用于自動化高通量分析?？墒褂脽晒庥嫽蛎笜藘x檢測熒光信號。
Bradford法
1976年Bradford建立了用考馬斯亮藍G-250與蛋白質結合的原理，是一種能夠迅速并且準確的定量蛋白質的方法。染料與蛋白質結合后引起染料最大吸收光的改變，從465nm變為595nm。蛋白質-染料復合物具有高的消光系數，因此大大提高了蛋白質測定的靈敏度(最低檢出量為1μg)。染料與蛋白質的結合是很迅速的過程，大約只需2min，結合物的顏色在1h內是穩定的。一些陽離子如K+，Na+，Mg2+、(NH4)2SO4、乙醇等物質不干擾測定，而大量的去污劑如TritonX-100，SDS等嚴重干擾測定，少量的去污劑可通過用適當的對照而消除。由于染色法簡單迅速，干擾物質少，靈敏度高，現已廣泛用于蛋白質含量的測定。
總氮量的測定——微量凱氏定氮法：當被測定的含氮有機物與濃硫酸共熱消化時，分解出氮、二氧化碳和水，其中氮與硫酸化合成硫酸銨。由于分解反應進行得很慢，故可加入硫酸銅和硫酸鉀或硫酸鈉，其中硫酸銅為催化劑，硫酸鉀或硫酸鈉可提高消化液的沸點，氧化劑(過氧化氫)也能加速反應。
消化終止后，在凱氏定氮儀中加入強堿堿化消化液，使硫酸氨分解放出氨;用水蒸氣蒸餾，將氨蒸入過量的標準無機酸溶液中，全部蒸完之后，用標準的鹽酸溶液滴定收集的氨量，準確測定氨量，從而折算出蛋白質含量。
雙縮脲法
具有兩個或兩個以上肽鍵的化合物皆有雙縮脲反應，蛋白質在堿性溶液中能與Cu2+絡合呈紫紅色，顏色深淺與蛋白質濃度成正比，故可用比色法進行測定，根據標準曲線進行計算可以確定蛋白質濃度。
Folin-酚試劑法
測定蛋白質含量的經典方法，它是在雙縮脲法的基礎上發展而來的。它操作簡單、迅速、靈敏度高，較雙縮脲法靈敏100倍。Folin-酚法所用的試劑由兩部分組成，試劑A相當于雙縮脲試劑。蛋白質中的肽鍵與試劑A中的堿性硫酸銅反應形成銅-蛋白質復合物。這個復合物可與試劑B中磷鉬酸-磷鎢酸發生氧化還原反應。由于磷鉬酸與磷鎢酸易被酚類化合物還原而呈藍色反應。而蛋白質中的酪氨酸和色氨酸均可發生此呈色反應。顏色的深淺與蛋白質的濃度成正比。故可用比色法測定蛋白質的含量。
此法易受蛋白質樣品中酚類化合物及檸檬酸的干擾。另外，試劑B中的磷鉬酸-磷鎢酸僅在酸性pH值時穩定，故在將試劑B加入到堿性的銅-蛋白質溶液時，必須立即混合均勻。以確保還原反應能正常發生。此法也適用與酪氨酸和色氨酸的定量測定。
五、蛋白檢測
根據實驗需要，可以使用多種方法來檢測和分析靶蛋白。以下是用于檢測和分析復雜混合物（例如裂解物和血清）中蛋白質的常見技術，以及各種技術的特點和常見要求。
